答疑呀嘿丨为什么分析到的差异表达基因与qPCR实验结果不一致?

是“其明”啊 GCBI知识库 2018-10-11

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又是一周答疑呀嘿时间到!

上周,你提了什么问题呢?

本周请了实验室的孔老师、生信分析部的谢老师和杨老师来回答大家的问题,感谢他们!

接下来,找一找你的问题与答案吧!

Q1-生信分析

问:接上期,基因组注释分析主要包括哪些内容?


答:基因组注释包括以下方面的内容:

  1.  重复序列的预测。通过比对已知的重复序列数据库,找出序列中包含的重复序列,识 别类型并转化为 N 或者 X,统计各种类型重复序列的分布。

  2. 编码基因的预测。通过将转录组或 EST 数据比对到拼接后的基因组序列上,找出编 码基因位置, 预测编码基因结构。 或者通过专业的外显子预测软件, 预测编码基因的外显子结构。

  3. 小 RNA 基因的预测。通过比对已知的小 RNA 的数据库,或者通过生物信息学软件预 测,找出这些小 RNA 基因,并进行分类。

  4. 调控序列和假基因的预测。 基因功能的注释,使用的数据库包括 NT/NR, SwissProt/TrEMbl, InterPro, KEGG, COG, Gene ontology 等,使用比对的方法,如 blast,找出同源相近的基因,并注释功能。


Q2-PCR

问:跑出来的条带拖尾是什么原因?谢谢解答


答:拖尾的可能原因:

  1. 模板不纯。建议纯化模板

  2. buffer不合适。建议更换buffer

  3. 退火温度偏低。建议适当提高退火温度

  4. 酶量过多。建议适量用酶

  5. dNTP,Mg2+浓度偏高。建议适当降低浓度

  6. 循环次数过多。建议减少循环次数。


Q3-外显子组测序

问:什么是外显子组测序?


答:外显子组测序(whole exon sequencing)是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集侯进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势,但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。


Q4-qPCR

问:为什么分析到的差异表达基因与qPCR实验结果不一致,无法被验证?


答:RNA-seq是大规模筛选用的,反应样本整体的基因表达变化趋势,但不能保证每一个基因的变化趋势都与qPCR保持一致。RNA-seq与RT-PCR本身就是两种不同的实验平台,两者不能一一对应。一般是挑选大量的基因验证,两者的结果从统计学上来说存在较高的相关性(r2>0.8),视为验证成功。


Q5-生信分析

问:lncRNA没法做GO、KEGG怎么办?差异lncRNA又太多怎么做靶基因?


答:可以进行lncRNA的cis作用靶基因预测和Trans作用靶基因预测,cis调控就是指非编码RNA对临近mRNA的一种转录激活与表达调控方式,而trans相反,则是对远端mRNA转录的调控。取lncRNA靶基因与差异基因的交集方可缩小范围,进而再对lncRNA靶基因进行GO_pathway分析,从而了解lncRNA的功能。


Q6-生信分析

问:这句话对芯片探针通过blast+重注释是什么意思呢?是对探针序列重新注释么?那么重新注释出来的结果会不会和之前平台注释文件结果一样呢?

是不是所有的GEO芯片的探针序列都可以用blast+来重新注释呢?尤其是那些芯片注释平台文件没有genesymbol等基因信息的。


答:首先,在芯片中,探针是一段与目标基因能够靶向互补结合的序列,在affymatrix 芯片中,由于注释库文件更新不是很及时,导致有些基因或者lncRNA的注释不全或者目前已经有更新的注释,在这种情况下,是可以使用blast+等软件对探针序列进行比对,目的就是看该探针能够比对到的基因组区域目前是什么注释信息,比对可能比对到一个刚刚注释的一个新的lncRNA,这样,该探针的信号强度就可以代表这个lncRNA的表达值。


     其次,理论上,所有探针都可以通过这样的方式进行重新注释,但是大多数蛋白编码基因,芯片本身的注释库一般是比较全的,变动也不会频繁,主要是一些非编码基因可以推荐使用这个方法,可能这也是问题中引用的文献中,对lncRNA进行重注释的原因。


Q7-生信分析

问:怎么理解GO/KEGG富集分析?


答:富集分析是将功能类似的基因集通过统计学检验算法富集到一起,从而方便研究具有某一类功能的基因,更快的获取研究相关的功能基因。


Q8-qPCR

问:lncRNA如果需要进行验证,引物设计怎么处理?


答:lncRNA最短的长度是200nt,可满足荧光定量PCR(100-200nt目的片段)的要求。不过由于lncRNA的保守性比较低,组织特异性比较强,扩增效率比较低,可能需要设计多对引物进行尝试。


以上就是本周的问题了!

你有什么见解,欢迎下方或后台留言给我们。

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